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          加味白頭翁散益生菌發酵產物的制備及其對肉仔雞大腸桿菌病的醫學防治分析

          來源: www.lov2go.com 發布時間:2020-03-11 論文字數:62366字
          論文編號: sb2020030222452929720 論文語言:中文 論文類型:博士畢業論文
          本文是一篇醫學論文,筆者認為.中藥發酵的益生菌為枯草芽孢桿菌;該菌株對加味白頭翁散進行發酵,可改變部分中藥成分及含量,產生了新的物質。發酵產物對仔雞致病性大腸桿菌感染有較
          本文是一篇醫學論文,筆者認為.中藥發酵的益生菌為枯草芽孢桿菌;該菌株對加味白頭翁散進行發酵,可改變部分中藥成分及含量,產生了新的物質。發酵產物對仔雞致病性大腸桿菌感染有較好的防治作用;加味白頭翁散發酵產物可提高肉仔雞淋巴器官指數,淋巴細胞轉化能力、紅細胞補體結合率,血清細胞因子含量;提高肉仔雞多種抗氧化指標,降低丙二醛含量。

          第 1 章 中藥防治雞大腸桿菌病研究進展

          1.1 雞致病性大腸桿菌的耐藥現狀
          1.1.1 雞致病性大腸桿菌耐藥性分析
          雞的致病性大腸桿菌耐藥性菌株不斷產生主要與抗生素的濫用有直接關系,臨床上分離的大部分致病性大腸桿菌對常用的抗菌藥物均產生了不同程度的耐藥性,而且在不同地區、同一地區不同時期分離的大腸桿菌菌株耐藥種類和耐藥程度都有很大的差異[11-14]。隨著抗菌藥物種類的不斷增加以及抗菌藥物的濫用,禽源大腸桿菌的耐藥譜也迅速擴大,交叉耐藥、多重耐藥現象越來越嚴重。
          朱恒乾[15]等對廣東地區禽源大腸桿菌的耐藥性進行研究,結果表明耐藥率逐年上升,主要集中在 5-12 種抗生素多重耐藥。郝智慧[16]等對山東省、河北省和遼寧省等不同區域肉雞病料中的 264 株大腸桿菌的 29 種抗菌藥的耐藥性進行檢測,結果表明山東省的雞大腸桿菌耐抗菌藥物的種類為 29 種、遼寧省的雞大腸桿菌耐抗菌藥物的種類 23 種。山東省、河北省和遼寧省三地的致病性大腸桿菌菌株對磺胺-6-甲氧嘧啶、氨芐西林鈉、土霉素、阿莫西林、酒石酸泰樂菌素 5種抗菌藥物的耐藥率均在 90.0 %以上;山東與河北的分離株對甲砜霉素 、山東及遼寧分離株對硫酸鏈霉素和鹽酸金霉素、河北及遼寧分離株對恩諾沙星和磷霉素鈉、遼寧分離株對甲磺酸達氟沙星、延胡索酸泰妙菌素的耐藥率均在 80.0 %以上。宋立[17]等從中國的華南、華中、華北及東北四地區共分離到 240 多株大腸桿菌,其耐藥性狀況非常的嚴重,并且以多重耐藥為主,某些地區內 50%以上的菌株甚至耐 10~19 種藥物。其中,對萘啶酸、四環素、磺胺甲基異惡唑等耐藥率高達 88.1%、85.7%、81.0%。對復方新諾明、氨芐西林以及阿莫西林等抗菌藥物的耐藥率也均在 70%以上;對鏈霉素、氟喹諾酮類以及氯霉素等耐藥率分別是66.2%、57.1%~66.7%、52.9%;而對氟苯尼考、阿米卡星、奧格門丁等新的抗菌藥物也已經出現了一定程度的耐藥。馮敏燕[18]等對山東省雞大腸桿菌耐藥變化趨勢研究結果表明,2008-2014 年分離鑒定的 210 株雞源大腸桿菌對頭孢噻呋、大觀霉素、多西環素、硫酸粘菌素、慶大霉素、環丙沙星、新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星等 14 種抗生素的耐藥性達 13 種,其中對 10 種抗生素的耐藥性翻了一翻。趙素華[19]等對 31 株致病性大腸桿菌耐藥性分析,結果表明對復方磺胺甲基異噁唑、阿莫西林、氟苯尼考等 11 種抗菌藥物均出現了不同程度的多重耐藥性;這些菌株對磺胺二甲嘧啶、復方磺胺甲基異噁唑、恩諾沙星耐藥比例在 70%以上;對慶大霉素、阿莫西林、氟苯尼考、鏈霉素、卡那霉素、環丙沙星耐藥比例在16%以上;對頭孢唑肟、頭孢噻肟、阿米卡星等新型抗菌藥物也出現接近 10%的耐藥性。毛福超[20]等從豫西地區分離鑒定的 98 株雞源大腸桿菌對 20 種抗生素的耐藥性分析表明,對復方新諾明的耐藥率高達 95.92%,對四環素的耐藥率為83.67%、對氨芐西林的耐藥率為 81.63%,對萘啶酸的耐藥率為 77.55%、對恩諾沙星的耐藥率為 69.39%。大多為多重耐藥性,其中有 2 株耐藥藥物的種類多達18 種抗生素,有 76 株致病性大腸桿菌對 9-14 種抗生素存在多重耐藥。
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          1.2 雞致病性大腸桿菌耐藥的生化機制
          在抗菌藥物的選擇性篩選壓力下,致病性大腸桿菌的耐藥性從單一耐藥到多重耐藥,再到超級耐藥,耐藥機制不斷的除舊布新,耐藥性基因通過突變獲得,還可通過轉座子、R 質粒以轉化、轉導、接合等水平方式在不同菌株之間進行傳遞,大大地提升了大腸桿菌病的防治難度。
          1.2.1 產酶耐藥
          大腸桿菌耐藥菌株能產生分解酶或鈍化酶,使抗菌藥物活性降低或完全失活。大腸桿菌能產生近 40 種的β-內酰胺酶[22],而β-內酰胺酶能破壞內酰胺環的靶位結構基團,使β-內酰胺類藥物失去活性從而產生耐藥性;大腸桿菌能產生氨基糖苷類修飾酶(例如乙酰轉移酶、核苷轉移酶和磷酸轉移酶),此酶作用于氨基糖苷類的抗生素后,可使抗生素游離的氨基被乙?;?、磷酸化、核苷化,結果就使抗菌藥物不能與作用的靶位結合,從而失去了抑菌活性;喹諾酮類藥物耐藥機制是氨基被氨基糖苷乙酰轉移酶乙?;a生耐藥[23,24];在氯霉素乙酰轉移酶作用下,氯霉素轉變為 3-乙酰氯霉素,就失去了與細菌的核糖體結合的能力,進而就喪失了其抗菌活性[25]。大腸桿菌可產生大環內酯磷酸轉移酶,可使大環內酯類的抗菌藥物的內酯環被破壞從而產生了耐藥性[26]。
          1.2.2 靶位結構改變
          抗菌藥物通過與細菌表面不同部位的靶位蛋白相結合,抑制靶位蛋白的功能發揮殺菌、抑菌作用。大腸桿菌通過修飾靶位蛋白結構、或大腸桿菌自身發生遺傳變異而改變抗生素靶位蛋白結構,使靶位蛋白結構與抗生素結合力下降、甚至不能結合而出現不同程度的耐藥。
          青霉素靶位蛋白主要的生物學功能是參與細菌細胞壁主要成分肽聚糖的合成、維持細菌細胞的外形,也能維持和調整糖肽結構。青霉素的靶位蛋白是β-內酰胺類的抗菌藥物特異性結合的靶位蛋白,抗菌藥物與靶位蛋白結合后就發揮抑制細菌細胞壁的形成而發揮其殺菌作用。當青霉素靶位蛋白的數量增加、減少或缺失,靶位蛋白與抗菌藥物的結合能力降低以及誤導性靶位蛋白的產生都會使大腸桿菌對β-內酰胺類抗生素表現出耐藥性。大腸桿菌核糖體 50s 亞基的改變使大腸桿菌對氟苯尼考和氯霉素耐藥[27]。而大腸桿菌核糖體 30s 亞基中 S12 靶位蛋白的改變就使大腸桿菌對氨基糖苷類抗菌藥物產生了耐藥性[28]。
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          第 2 章 中藥發酵研究進展

          2.1 中草藥發酵機理及優勢
          中草藥的發酵是微生物在適宜的條件下、在新陳代謝的過程中產生纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶等多種胞外酶系,可將植物細胞壁中的纖維素、半纖維素、果膠等成分降解,促進生物活性成分的釋放,催化其他物質進行酯化、氧化、甲基化和還原等生物化學反應。而且中草藥中一般都會含有氨基酸、礦物元素、有機酸類、脂類、生物酶類等人和動物生長發育所需要的多種營養元素和生物活性物質[58],常溫、常壓等溫和的發酵可減少傳統中草藥炮制工藝煮、煎、蒸、熬、煉、浸等對營養元素、維生素、芳香類揮發油等生物活性成分的破壞,最大限度的提取了中草藥生物活性成分或轉化原有的成分,還可通過生物轉化分解毒性物質。同時,益生菌等微生物與中草藥具有協同增效的作用,可促進中草藥有效成分的吸收,也提高機體的抗病能力。
          2.1.1 降解中草藥傳質屏障,提高有效組分的含量
          植物中草藥的生物活性物質在細胞內,往往被致密的堅韌的細胞壁所包裹,而細胞壁主要是由纖維素等成分構成,生物活性物質要從中草藥的胞漿擴散到提取介質中,就必須沖破植物細胞壁及細胞間質的雙重阻力。除此以外,中草藥的細胞中還含有果膠、蛋白質等復雜成分。利用微生物發酵過程中產生的纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等幾十種胞外酶,酶反應能使中草藥的細胞壁結構發生降解,有效去除果膠、蛋白等化學成分,促使中草藥中的具生物活性的有效成份向提取介質中擴散,從而提高生物活性物質的溶出率。
          圖 1.3 CCTCC M 2011286 16S r DNA PCR 擴增結果
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          2.2 益生菌發酵中草藥研究進展
          益生菌是微生物在與動物機體長期進化過程中形成的對宿主有益的活性微生物,定植于人及動物的消化系統、生殖系統等與外界相通的體腔中,能產生健康的功效,從而改善宿主的微生態平衡、發揮有益作用的活性有益微生物的總稱。益生菌進入動物消化道后,發揮著重要的生物學功能[80,81]:合成氨基酸、維生素等營養物質;產生次生的代謝產物,促進生物轉化;產生抑菌物質,直接拮抗病原菌;與病原菌進行占位競爭,增強屏障功能;產生有益物質,降低炎癥反應;刺激機體免疫系統的完善,從而通過生物拮抗、營養、免疫、抗衰老及抗腫瘤等作用達到防治消化道疾病和促進生長的雙重作用。
          目前,臨床上被大眾廣泛應用的益生菌主要包括三大類[82]:一是雙歧桿菌類(例如長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌等);二是乳桿菌類(例如干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、詹氏乳桿菌等);三是革蘭氏陽性球菌(例如糞鏈球菌、乳球菌、中介鏈球菌等)。此外,還包括酪酸梭菌、酵母菌、芽孢桿菌等。而利用微生態調節劑或生態制劑,具有直接補充或促進宿主有益微生物生長的作用,能夠維持或調整微生態平衡,從而能達到防病治病、增強宿主抵抗力的作用。
          2.2.1 中草藥對益生菌的促生長作用
          大量的研究表明,許多中草藥[83,84]發揮著益生元作用,對腸道的益生菌具有促生長的作用,特別是如黃芪、甘草等的益氣類中草藥。中草藥中除含有大量的具有藥理作用的活性成分外,還含有蛋白質、維生素和微量元素等多種營養成分,促進益生菌的生長與繁殖,增加腸道益生菌如雙歧桿菌、乳酸菌等的種類和數量,對維持動物機體的微生態動態平衡發揮著十分關鍵作用。中草藥的益生元作用機理明顯優于寡糖、果膠等益生元,中草藥的營養成分促進腸道有益菌的快速增殖,生物活性物質抑制有害菌的生長和增殖,甚至還能抑制或殺滅有害菌,為益生菌的大量增殖掃清障礙,進一步促進腸道益生菌的生長,具有藥理和益生元的雙重作用。與此不同的寡糖、果膠等益生元對腸道菌的促生長作用不具有特異性,對有益菌和有害菌均促進作用。
          圖 1.5 CCTCC M 2011286 系統發育樹構建
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          第 3 章 加味白頭翁散發酵產物防治肉仔雞大腸桿菌病對肉仔雞免疫功能的影響....................35
          3.1 材料與方法................................... 36
          3.1.1 材料.................................36
          3.1.2 方法..................................36
          第 4 章 加味白頭翁散發酵產物對大腸桿菌感染肉仔雞腸道菌群的調節作用...................71
          4.1 材料與方法...................................... 71
          4.1.1 材料................................71
          4.2 方法..................................... 72
          第 5 章 加味白頭翁散發酵產物在肉仔雞無抗養殖中的應用..............................83
          5.1 材料與方法.............................. 83
          5.1.1 材料....................................83
          5.1.2 方法..................................83

          第 5 章 加味白頭翁散發酵產物在肉仔雞無抗養殖中的應用

          5.1 討論
          加味白頭翁散發酵產物組改善 ROSS 308 肉雞生產性能效果最為明顯,其 0-1周齡、1-2 周齡、2-3 周齡、3-4 周齡、4-5 周齡、0-5 周齡的周增重分別比正常對照提高 10.55%、7.32%、16.51%、12.57%、9.8%和 13.89%,日增重分別提高 10.49%、7.32%、16.49%、12.57%、9.78%和 11.49%,料肉比分別下降 2.1%、3.45%、5.6%、9.09%、7.98%和 6.25%, 死淘率分別下降 10.87%、16.58%、17.23%、25.24%、26.14%和 21.60%。
          發酵中藥是指中藥材或其提取液經一種或多種益生微生物發酵后獲得的中藥制劑。通過益生菌發酵的中藥材或其提取液,不但可增加中藥的有效成分,而且還含有益生菌及益生菌多種次級代謝產物等。在益生菌、益生菌次級代謝產物和中藥的有效成分共同作用下,腸道微生態菌群能迅速調整至微生態平衡狀態,動物機體對中藥有效成分和營養物質的吸收利用率得以提高,動物機體的生產性能和免疫力增強,死淘率降低。
          韓春楊[94]等比較了黃芪、黨參、茯苓、山楂、麥芽和白術等中草藥復方制劑發酵前后成分的變化,發現發酵過程中藥成分發生了較大的變化:有些成分的含量升高了 10-30%,出現一些新的特征性吸收峰,還有吸收峰消失的情況。同時,將該中藥發酵制劑飼喂肉雞后,發現肉雞免疫功能和生產性能均高于未發酵制劑組。劉觀忠[95]等研究發現黃芪、貫眾、板藍根、何首烏、山楂、女貞子、艾葉等中草藥發酵產物可促進仔雞的生產性能、提高飼料轉化率。謝全喜[92]等發現 1%李糖乳桿菌發酵中草藥復合枯草芽孢桿菌能增強白羽肉仔雞抗病能力,抵抗大腸桿菌感染,顯著降低死淘率。史洪濤[173]研究發現黃芪-枯草芽孢桿菌發酵制劑能夠顯著提高 AA 肉雞的生產性能和免疫功能,而且效果優于抗生素對照組,可以完全替代抗生素。張凱[174]等將黃芪提取物發酵后飼喂肉仔雞發現,發酵型黃芪提取物可明顯促進肉仔雞的生產性能以及健康狀況。唐燕紅[175]研究結果表明,微生物發酵中藥能顯著提高肉仔雞的日增重和日采食量,料肉比有下降的趨勢,肉仔雞的生產性能提高;肉仔雞免疫功能和抗病力增強,作用效果要優于抗生素,可替代抗生素應用于肉仔雞養殖。戴燊[176]將混菌發酵中草藥替代抗生素飼喂肉仔雞,結果表明混菌發酵中草藥可顯著提高日增重、日采食量,料肉比差異不顯著,混菌發酵中草藥可增強肉仔雞的抗病能力。
          ...................................

          結論
          1.中藥發酵的益生菌為枯草芽孢桿菌;該菌株對加味白頭翁散進行發酵,可改變部分中藥成分及含量,產生了新的物質。發酵產物對仔雞致病性大腸桿菌感染有較好的防治作用。
          2.加味白頭翁散發酵產物可提高肉仔雞淋巴器官指數,淋巴細胞轉化能力、紅細胞補體結合率,血清細胞因子含量;提高肉仔雞多種抗氧化指標,降低丙二醛含量。
          3.加味白頭翁散發酵產物促進肉仔雞盲腸菌群微生物種類增加、提高菌群多樣性;顯著提高 ROSS 308 肉雞生產性能、顯著降低死淘率。具有較好的推廣應用潛力。
          參考文獻(略)

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